Reprodukovatelnost ve výzkumu biologie rakoviny: Nastavení

Reprodukovatelnost ve výzkumu biologie rakoviny: Nastavení

V té době Dr. Judah Folkman nedávno publikoval články popisující inhibitory angiogeneze angiostatin a endostatin a jak nápadně zmenšovaly nádory až do bodu, kdy se staly spící jako malý shluk buněk, které nerostly. V té době se objevilo mnoho přehnaných titulků ve smyslu „Je tohle lék na rakovinu? (Střesu se při pomyšlení, jaké by bylo zpravodajství, kdyby v té době existoval Facebook, Twitter a podobně.) Inhibitory angiogeneze blokují tvorbu krevních cév tím, že blokují působení faktorů vylučovaných nádorem, aby vyvolaly růst nových krevní cévy, aby krmily svůj růst, a tím znemožňovaly normální fyziologický proces angiogeneze. Naše laboratoř chtěla zkombinovat angiostatin a radiační terapii na zvířecím modelu, abychom zjistili, zda jsou účinky aditivní nebo synergické.

Naše výsledky byly nakonec publikovány v Nature, jediném článku Nature v mém životopise, ale cesta k těmto výsledkům nebyla přímá. Prostřednictvím vinné révy bylo v té době všeobecně známo, že jiné laboratoře měly potíže s reprodukcí Folkmanových pozoruhodných výsledků. V našem případě jsme nepozorovali zdaleka tak silný protinádorový účinek, jaký Folkman popsal u angiostatinu v naší skupině se samotným angiostatinem, kterou jsme chtěli porovnat se skupinou myší léčených angiostatinem i radiační terapií. Zajímalo nás, jestli to má něco společného se samotným angiostatinem, který naši spolupracovníci vytvářeli v bakteriích z plazmidu. Vzhledem k tomu, že Folkman byl jedním z nejlepších vědců, které jsem kdy potkal, nikdo z nás nepochyboval o jeho výsledcích a předpokládal, že to musí být něco, co děláme.

Ve skutečnosti to tak bylo. Kontaktovali jsme Folkmana, který poskytl reagencie, protokoly a rady, stejně jako nějaký angiostatin vyrobený v jeho laboratoři. Ukázalo se, že peptid, který jsme vyráběli, byl snadno denaturován (rozbalen), což byl důvod, proč nebyl tak účinný, jak Folkman uvedl. Tady je důvod, proč říkám, že jsme nemohli replikovat jeho výsledky. Je to proto, že jsme nemohli plně replikovat jeho výsledky. Náš angiostatin inhiboval růst široké škály nádorů, ale i po aplikaci úprav produkce angiostatinu navržených Folkmanem v našich rukou angiostatin nikdy neinhiboval růst nádoru tak silně, jak Folkman uvedl. Jinými slovy, mohlo se snadno stát něco jiného, ​​na co jsme nikdy nepřišli. Ať je to jakkoli, Folkman měl nejlepší přístup, jaký jsem kdy u vědce viděl, pokud jde o reprodukovatelnost, jak jsme se později dozvěděli, když jsme slyšeli, jak totéž udělal pro několik dalších laboratoří, dokonce až do té míry, že poslal jeho postdoktorandů, aby pomohli dalším vyšetřovatelům uvést angiostatin a endostatin do práce. Přesto jen málo vyšetřovatelů dokázalo zcela zopakovat Folkmanovy počáteční výsledky, i když mnozí, včetně naší laboratoře, prokázali, že angiostatin a endostatin jsou silné inhibitory angiogeneze.

Proč tedy opakuji tuto anekdotu téměř pokaždé, když se objeví diskuse o vědecké reprodukovatelnosti? Jednoduchý. Je to pro ilustraci, že reprodukovatelnost spadá do spektra. Nepodařilo se nám reprodukovat Folkmanovy výsledky? Ano i ne. Ano, reprodukovali jsme klíčový výsledek, že angiostatin inhibuje růst nádoru blokováním angiogeneze, ale ne, nereprodukovali jsme stejnou velmi silnou velikost účinku, kterou uvádí Folkman. Jde o to, že replikace jakéhokoli daného vědeckého nálezu se může pohybovat od úplného selhání replikace (např. pokud se nám nepodařilo prokázat vůbec žádný protinádorový účinek angiostatinu) k částečnému selhání replikace (např. co se skutečně stalo) až k úspěchu při replikaci. (např. ukázali jsme, že angiostatin blokuje růst nádoru u angiostatinu ve skupině stejně silně jako Folkman). Všechno se to ještě více zamotá, když uvážíme, že neexistuje žádná standardní definice nebo jasný konsensus ohledně toho, co představuje a co není vědecká reprodukovatelnost.

Jednou ze silných stránek počátečních výsledků projektu Reproducibility Project: Cancer Biology je, že tento nepořádek je oceněn a vysvětlen.

Reprodukovatelnost ve výzkumu biologie rakoviny: Nastavení

Než budu diskutovat o výsledcích, měl bych vysvětlit trochu více o tom, co projekt Reproducibility Project: Cancer Biology je a co dělá. Stručně řečeno, projekt Reproducibility Project: Cancer Biology, který byl založen v roce 2014, vytvořil základní tým pro navrhování, přípravu a monitorování projektových operací věnovaných testování reprodukovatelnosti výsledků hlášených v 50 vysoce působivých dokumentech publikovaných v letech 2010 až 2012. plán byl replikovat podmnožinu experimentálních výsledků z každého článku. Pro každý vybraný článek měla být před sběrem dat recenzována a publikována registrovaná zpráva s podrobnostmi o navrhovaných experimentálních designech a protokolech pro každou podskupinu experimentů, které se měly replikovat. Po dokončení sběru dat měly být výsledky publikovány jako studie replikace. Zpráva, která přinesla zprávy minulý týden, představuje výsledky studií replikace pro prvních pět vybraných článků.

Zde je pět dokumentů s odkazy na Registrovanou zprávu a Studii replikace pro každý z nich:

BET inhibice bromodomény jako terapeutická strategie cílení na c-Myc (registrovaná zpráva; replikační studie).Společné podávání tumor-penetrujícího peptidu zvyšuje účinnost léků na rakovinu (registrovaná zpráva; replikační studie).Zjištění a preklinické ověření indikací léků pomocí kompendií veřejných dat o expresi genů (registrovaná zpráva; studie replikace).Interakce CD47-signální regulační protein alfa (SIRPa) je terapeutickým cílem pro lidské solidní nádory (Registered Report; Replication Study).Sekvenování melanomového genomu odhaluje časté mutace PREX2 (Registered Report; Replication Study).

Zde je váš úkol čtení. Ne, dělám si srandu. Odkazy uvádím pouze proto, aby čtenářům, kteří o to mají zájem, usnadnil kontrolu studií a studií replikace, pokud jsou tak nakloněni. Také je snazší odkazovat na každou studii podle čísla. Ale jak byly tyto studie vybrány? To je správná otázka.

Takže to, co vidíme, je jen jedna desetina původního plánu. Ve skutečnosti je to víc než to, protože na konci roku 2015 projekt Reproducibility Project: Cancer Biology oznámil, že musel omezit své ambice a nyní plánuje udělat pouze 37 prací, převážně kvůli rozpočtovým omezením. Jako trochu reality kontroly úsilí o reprodukovatelnost podotýkám, že projekt původně plánoval rozpočet kolem 25 000 až 35 000 $ na každý experiment, ale toto číslo se ukázalo jako příliš nízké. Díky časově náročným vzájemným hodnocením, dohodám o převodu materiálu a drahým pokusům na zvířatech tým dospěl k novým odhadovaným nákladům v průměru na 40 000 dolarů na experiment. To je samozřejmě jeden z důvodů, proč se replikace neprovádějí tak často, jak by měly. Ve skutečnosti jich nyní bude provedeno pouze 29, a to díky rozpočtovým problémům a potížím, které vyšetřovatelé měli při získávání informací a materiálů.

Zaznamenal jsem také neodmyslitelnou zaujatost ve výběru dokumentů. Vysoce citované zprávy nebo zprávy s „vysokým dopadem“ bývají nejnovější, nejzajímavější nebo dokonce nejkontroverznější (tj. opět „špičkové“), což také znamená, že se opět jedná o „hraniční vědu“, jejíž výsledky jsou častěji převráceny.

Než budu diskutovat o skutečných výsledcích, zde je další vráska, která se hodí ke zdůraznění složitosti těchto replikačních studií. Nemohu si pomoci, ale krátce citovat samotné Nosek a Errington:

Přímá replikace je definována jako pokus reprodukovat dříve pozorovaný výsledek postupem, který neposkytuje žádný apriorní důvod očekávat jiný výsledek (Open Science Collaboration, 2015; Schmidt, 2009). Při přímé replikaci se postupuje podle protokolů z původní studie s různými vzorky stejných nebo podobných materiálů: přímá replikace jako taková odráží současná přesvědčení o tom, co je potřeba k vytvoření nálezu. Provádění přímé replikace tyto názory empiricky testuje. Na druhé straně při koncepční replikaci se k testování stejné hypotézy používá odlišná metodologie (jako je jiná experimentální technika nebo jiný model nemoci): jako takové mohou koncepční replikace poskytnout důkazy, které umožňují použití více metodologií. výzkumníků, aby se sblížili s vysvětlením nálezu, který není závislý na žádné metodice.

Většina replikace ve vědě je koncepční replikace.

Reprodukovatelnost ve výzkumu rakoviny: Výsledky

Nosek a Errington popisují výsledky prvních pěti replikačních dokumentů:

Nejprve se podívejme na jasné selhání replikace (#2). Původní práce popsala účinky tumor-penetrujícího peptidu (krátký protein), iRGD peptidu, který v článku zvýšil buněčnou absorpci chemoterapeutického činidla doxorubicinu v xenograftovém modelu rakoviny prostaty. Model xenoimplantátu zahrnuje injekci lidských nádorových buněk do imunosuprimovaných myší a měření jejich růstu a schopnosti testované intervence inhibovat nebo zvrátit tento růst. Replikační studie v zásadě nedokázala najít statisticky významné rozdíly v penetraci doxorubicinu do nádorových buněk, hmotnosti nádoru u myší léčených DOX a iRGD ve srovnání se samotným DOX ani v míře programované buněčné smrti (apoptózy).

Ani jedna ze dvou studií, u nichž se uvádí, že byly replikovány (č. 1 a č. 3), nebyla přesně přesvědčivou replikací. Například v #3 byly výsledky smíšené, jak je popsáno v doprovodném komentáři. V původním článku autoři například poznamenali, že cimetidin vyvolal smrt buněčné linie lidské rakoviny plic A549. Testovali tedy tři dávky léku proti nádorovým xenoimplantátům A549 (nádorové buňky implantované do myší) a všimli si, že cimetidin snižuje rychlost růstu těchto buněk, což je účinek, který byl statisticky významný, účinek, který byl téměř stejně silný jako účinek nízkého dávka doxorubicinu, chemoterapeutika. V replikační studii bylo zjištěno, že cimetidin stále redukoval zmenšení velikosti nádoru, ale nebylo statisticky významné, když byla použita Bonferroniho korekce pro vícenásobná srovnání. Byl však pozorován statisticky významný účinek, když byl datový soubor ze studie replikace kombinován s datovým souborem z původního článku v metaanalýze. Co mě zaujalo, bylo, že doxorubicin také nedokázal poskytnout statisticky významný výsledek ve studii replikace. Doxorubicin je silné chemoterapeutické činidlo; takže se musím zeptat, co se dělo ve studii replikace. Ať je to jakkoli, jak je uvedeno v komentáři, může existovat mnoho faktorů, které ovlivňují robustnost xenograftových modelů používaných v těchto experimentech, včetně „účinků šarže na účinnost použitých léků; změny vlastností buněčných linií v průběhu času; kmeny použitých myší a také jejich pohlaví; faktory související s mikrobiomem a potravou; cirkadiánní účinky; teplota; a antimikrobiální látky, které mohou být použity v určitých zařízeních.“

Druhá studie (č. 1) byla také poněkud smíšená. Jak je uvedeno v doprovodném komentáři, léčba testovaná na myších fungovala při snižování hladiny c-Myc (cílený gen) v buněčných liniích mnohočetného myelomu a zvyšovala celkové přežití myší v použitém modelu nádoru, ale výsledky měřeno bioluminiscencí nebyly statisticky významné. Spekuluje se, že to bylo proto, že mnoho kontrolních myší muselo být usmrceno brzy před jejich předem stanoveným koncovým bodem kvůli progresi onemocnění a vysoké nádorové zátěži.

Ve skutečnosti každý, kdo někdy prováděl experimenty s xenografty nádorů u myší, se setkal s problémem, že nádory buď rostou tak rychle, že myši musí být usmrceny před plánovaným koncem experimentu, nebo nerostou vůbec. Určitě mám. To je důvod, proč jsou další dvě studie neinterpretovatelné. V č. 4 vykazovalo několik nádorů spontánní regresi a v jedné replikační studii (č. 5) rostly xenoimplantáty melanomu v kontrolní skupině mnohem rychleji než v původní studii, což umožnilo detekci zrychleného růstu nádoru v důsledku mutací v Gen PREX 2 velmi obtížně detekovatelný ve srovnání s původní studií. Dokonce i autor doprovodného komentáře vypadal zmateně:

Jako někdo, kdo provedl několik xenograftových experimentů v kariéře od 90. let minulého století, odhaduji, že z jakéhokoli důvodu byl počet injikovaných nádorových buněk ve studii replikace příliš vysoký pro myši a podmínky, z jakéhokoli důvodu. V chování nádorů existuje velká biologická variabilita a mnoho faktorů, které mohou ovlivnit jejich názory na intenskin růst, které nemusí být zřejmé. To je důvod, proč, pokud provádíte experimenty v jiné instituci, je velmi vhodné provést předběžné experimenty dávka-odpověď ke stanovení optimálního počtu buněk k injekci. Také to, co všechny studie replikace naznačují, ať už replikovaly klíčové části původních studií nebo ne, je to, že mnoho experimentů na zvířatech uváděných v literatuře nemá dostatečné síly k testování uvažovaných hypotéz.

Vědci reagují

Není překvapením, že někteří vědci nejsou zrovna fanoušky projektu reprodukovatelnosti. Například Robert Weinberg, jehož jedna ze studií je projekt reprodukovatelnosti, který je v současné době pozastaven, není nadšený, když řekl: „Je to naivita, že pouhým přijetím této etiky, která zní eminentně rozumně, lze vyčistit Augeovy stáje. vědy.” Možná, ale přesně neříká, co je na této etice špatného.

Ostatní vědci reagují takto:

Jiní říkají:

Téměř každý vědec, na kterého se projekt zaměřil a který mluvil s Science, souhlasí s tím, že studie v biologii rakoviny, stejně jako v mnoha jiných oblastech, se příliš často ukazují jako nereprodukovatelné z důvodů, jako jsou problematická činidla a nestálost biologických systémů. Ale jen málokdo se cítí dobře s tímto konkrétním úsilím, které plánuje oznámit svá zjištění v nadcházejících měsících. Jejich reakce se pohybují od otrávenosti přes úzkost až po rozhořčení. “Je to obdivuhodné, ambiciózní úsilí. Líbí se mi ten koncept,“ říká genetik rakoviny Todd Golub z Broad Institute v Cambridge, který má na seznamu skupiny dokument. Je však „znepokojen tím, že jediná skupina používá vědce bez hlubokých odborných znalostí k reprodukci desetiletí komplikovaných experimentů s jemnými nuancemi“.

To není bezdůvodná obava. Stejně tak Erkki Ruoslahti, autor jedné studie, která zjevně nedokázala replikovat:

Ruoslahti, biolog zabývající se rakovinou v Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute v La Jolla v Kalifornii, zpochybňuje verdikt ohledně svého výzkumu. Koneckonců, nejméně deset laboratoří ve Spojených státech, Evropě, Číně, Jižní Koreji a Japonsku potvrdilo dokument z roku 20101, ve kterém poprvé uvedl hodnotu léku, peptidu určeného k pronikání do nádorů a zvýšení schopnosti zabíjet rakovinu. jiné chemoterapeutické látky. „Oklamaly se tři generace postdoktorandů v mé laboratoři a všichni tito ostatní lidé udělali totéž? Těžko tomu uvěřím,“ říká.

Saya siap membantu anda untuk Tanya, Penawaran, Atau Pemesanan Tas. Silahkan hubungi Customer Services kami dibawah ini :

Chat with us on WhatsApp